Production of aminopeptidase from soybean meal with nutrients
supplementation by Bacillus licheniformis SWJS33: Feasibility and
metabolic process
地衣芽孢杆菌 SWJS33以豆粕为底物及适当营养补充生产氨肽酶：可行性及
代谢过程
Abstract：
Enhancing aminopeptidase fermentation using cheap substrate is very necessary for industrial production and application of aminopeptidase. The suitability of using raw soybean meal (SBM) as substrate for aminopeptidase production by Bacillus licheniformis SWJS33 in submerged fermentation was first evaluated. SBM alone provided both nitrogen and carbon sources for SWJS33 to produce aminopeptidase. Supplementation of 3 g/L glucose and 15 g/L yeast extract further improved the aminopeptidase yield by 0.63 and 1.3 folds, respectively. Addition of yeast extract altered the metabolic process of SWJS33, including shortening the lag phase, increasing the maximum specific cell growth rate and maximum specific aminopeptidase formation rate, and changing the utilization process of nutrients during the fermentation. What’s more, SWJS33 secreted aminopeptidase prior to endoproteases when quick-release nitrogen (e.g. yeast extract) was supplied. High dissolved oxygen was demanded during aminopeptidase fermentation. The aminopeptidase production was successfully up scaled to 20 L fermenter.
中文摘要：
利用廉价的底物发酵生产氨肽酶并提高其产量对氨肽酶的工业化生产和应用十分必要。首次评价了地衣芽孢杆菌 SWJS33 使用大豆粕作为底物液态发酵生产氨肽酶的可行性。单独以大豆粕作为底物可以为 SWJS33 提供生产氨肽酶所需的氮源和碳源，分别补充 3 g/L 葡萄糖和 15 g/L 酵母提取物可进一步分别将氨肽酶的产量提高0.63倍和 1.3倍。酵母提取物的添加改变了SWJS33的代谢过程，包括缩短菌种的延迟期、提高菌体的比生长速率和产物比合成速率及改变发酵过程中营养物质的利用过程。更重要的是，当提供速效氮源（例如酵母提取物）时，SWJS33会优先分泌氨肽酶而不是内切蛋白酶。氨肽酶发酵过程对溶氧有较高的需求。氨肽酶的生产成功扩大到20 L发酵罐中。
主要结果、结论：
高温大豆粕可直接作为菌株SWJS33发酵产氨肽酶的底物，同时提供碳源、氮源。但在发酵初期补充3 g/L葡萄糖或15 g/L酵母提取粉能分别将产氨肽酶产量提高73.7%与53.7%，表明发酵初期补充速效的氮源或碳源能更好地促进菌体生长和产氨肽酶。补充酵母提取粉能有效的缩短菌种的延迟期，提高菌体的比生长速率和产物比合成速率，并缩短二者达到最大值的时间。充足的速效氮源能改变菌株的代谢过程，使其从糖类的代谢更快地转变为氮源的代谢，提高氨肽酶的产量。在2.5 L发酵罐中优化条件为：大豆粕20 g/L，酵母提取粉10 g/L，氯化钠20 g/L，初始pH7.2，接种量3%，装液量60%，温度37 ℃，搅拌300 rpm，通气量3.5 L/min，自动流加消泡剂，发酵时间42 h。优化下氨肽酶活力达4.95 LAP/mL，与以葡萄糖、酵母提取粉为营养物质摇瓶发酵相比提高了1.6倍。实现了SWJS33在20 L发酵罐中放大生产，培养基及发酵条件为：大豆粕20 g/L，酵母提取粉10 g/L，氯化钠20 g/L，消泡剂0.05%，初始pH 7.2；装液量12 L，接种量8%，温度37 ℃，搅拌400 rpm，通气量5 L/min，发酵时间42 h；发酵液氨肽酶活力为4.35 LAP/mL，与2.5 L小罐相比降低了12.1%。
目的、意义：发酵培养基是酶制剂工业生产的一项主要支出，高达总成本的30%–40，因此，选择廉价的发酵底物，并对发酵培养基及发酵条件进行优化以实现发酵底物的高效利用，是降低酶制剂生产成本的重要途径。大豆粕是大豆榨油后的副产物，因其较高的蛋白含量和合理的氨基酸组成而被当作廉价的蛋白质资源广泛应用于食品及饲料行业中。大豆粕资源数量可观，在大豆榨油工艺中，会产生占总质量约75%的副产物大豆粕（蛋白含量45–52%，碳水化合物含量在25–35%），大豆粕的高附加值利用具有重要意义。微生物的代谢过程极大地受到培养基和发酵条件的交互影响。发酵罐中的物理、生物因素都与摇瓶有较大的差异，发酵过程从实验室到工业生产的扩大的难点在于影响扩大发酵过程的因素较难评价和控制。如何设计发酵条件和扩大过程对实现从实验室到工业生产规模的发酵是一个重要的挑战。本研究以大豆粕为底物，针对影响微生物发酵产酶的主要因素，如培养基组成、pH、搅拌速度、通气量、接种量等，对菌株SWJS33氨肽酶发酵的培养基和发酵条件进行了深入优化。采用2.5L发酵罐研究了仅以大豆粕为底物及补充氮源或碳源对SWJS33菌体生长和产物合成的影响，并在20L发酵罐中实现了初步放大发酵。通过优化可以为酶学性质研究及应用研究提供大量的氨肽酶，同时为大规模放大生产氨肽酶奠定一定的基础。
第一作者、通讯作者：
雷芬芬，女，武汉轻工大学食品科学与工程学院，讲师。华南理工大学食品科学专业博士。主要从事油脂加工及油料资源综合开发利用、功能性油脂关键成分挖掘与活性评价、功能性油脂活性递送、植物蛋白及多肽功能活性研究及开发等方面的研究研究工作。主持湖北省教育厅科研计划项目目1项，标准制定项目1项，参与纵横向项目3项，以第一/通讯作者发表学术论文20余篇，其中SCI论文9篇。申请国家发明专利8项，授权3项。参与《食品工厂设计》及《菜籽油加工技术》书籍的撰写。
学生简介：
陈雅琪，女，武汉轻工大学食品学院2019级硕士研究生。主要研究方向为南瓜籽油Pickering乳液的制备及其稳定性与消化特性的研究，以第一作者在国内核心期刊上发表研究论文3篇。参与湖北省重大专项1项，参与《国家标准》1项、《行业标准》2项的制定工作，获金龙鱼卓越奖学金、天星粮油一等奖学金等。
论文原文：
